История не оставила свидетельств о том, кто был инициатором строительства и кто выбирал проект будущего храма. Скорее всего, инициатива, как и прежде, принадлежала ростовским купцам, которые вошли в Попечительский совет по постройке соборной церкви. Исследователь ростовской церковной старины И.Я. Александров называет следующие имена, повествуя о “строителях” собора:
- Федор Михайлович Нефедов (ум. 18 октября 1852 г.)
- протоиерей Григорий Щербинский (ум. в 1855 г.)
- Козьма Григорьевич Краморенко (ум. 10 мая 1873 г.)
- Семен Николаевич Кошкин (ум. 21 июня 1882 г.)
В 1845 г. ростовское купечество начало ходатайства о постройке соборного храма во имя Рождества Пресвятой Богородицы. Первый этап предполагал наличие проекта будущей церкви. В соответствии с представлениями купцов имевший статус собора храм должен был сочетать в себе обширное пространство, величественность, красоту и формы, которые сделали бы его даже визуально центром развивающегося города. Удовлетворяющим перечисленным требованиям оказался проект Введенской церкви лейб-гвардии Семеновского полка, составленный в нововизантийском стиле известным архитектором К.А. Тоном. Для адаптации проекта под условия Ростова был привлечен архитектор А.С. Кутепов.
После выбора проекта и составления чертежей в 1845 г. начались ходатайства Попечительского совета по постройке соборной церкви о разрешении на строительство храма. Уже 30 апреля 1845 г. Св. Синод рассматривал представление преосвященного Иннокентия (Александрова), епископа Екатеринославского и Таганрогского, и проект “на построение в Ростове вместо существующей ныне ветхой соборной Рождество-Богородичной вновь каменной церкви”. 20 апреля 1847 г., после получения всех необходимых разрешений от Главного управления путей сообщения и публичных зданий, Св. Синода и утверждения проекта императором Николаем I, состоялась закладка собора Рождества Пресвятой Богородицы. Подготовительные работы, в т.ч. в связи с Крымской войной 1853-1856 гг, длились 8 лет.
К 1860 г. храм был возведен, однако еще несколько лет продолжались работы по внутренней отделке, созданию иконостасов и т.п. После окончания строительства храма и разборки старого собора была упразднена и перестроена “теплая” церковь во имя Трех Святителей, переоборудованная под церковно-приходскую школу.
В 1880 г. в соборе проводились первые ремонтные работы: были отремонтированы и окрашены крыша и водосточные трубы, окрашены полы, отремонтированы и окрашены оконные рамы во всех куполах, вставлены стекла, “помыты” иконостасы с “исправлением местами покраски”.
С 1890 по 1892 г. за средства ростовского купечества проводилась роспись собора (за исключением алтарей) масляными красками.